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3. DISKUSSION 90

3 Diskussion

3.1 Klonierung der reifen ROL in Pichia pastoris Expressionsvektoren

und Transformation in Pichia pastoris

3.1.1 Klonierung und Transformation des ROL Gens in Pichia pastoris

Im Laufe der letzten Jahre wurde eine ganze Reihe verschiedenster Proteine in diesem

Expressionssystem, mit oder ohne α-Faktor zur Sekretion, in aktiver Form exprimiert (siehe

Kapitel 1.2.2.2). Neben der stabilen Integration in das Pichia pastoris Genom, die keinen Zu-

satz von Antibiotika während der Kultivierung erfordert, sind insbesondere die hohen Ex-

pressionsraten ein Vorteil dieses Systems.

Die Lipase aus Rhizopus oryzae wurde in einer früheren Arbeit von Beer et al. aus einer par-

tiellen chromosomalen Genbank in E. coli kloniert und unter der Kontrolle eines hitze-

induzierbaren Promotors (siehe Abbildung 2.1) exprimiert (Beer 1994, Beer, et al. 1998). Die

Produktion der Lipase in E. coli führt jedoch zur Bildung von inaktiven Inclusion Bodies die

erst in einer zeitaufwendigen Refolding-Prozedur renaturiert werden müssen. Der Erfolg die-

ser Renaturierung erfordert zumindest in einem Schritt hohe Puffervolumina, was die

Methode für die Aufreinigung eines größeren Kultivierungsansatzes (>1 l) ungeeignet er-

scheinen ließ. Um diese Probleme zu umgehen, wurde der von Beer et al. hergestellte Vektor

als Ausgangspunkt für die Klonierung und Expression der reifen ROL in Pichia pastoris ver-

wendet.

Das Gen der reifen ROL wurde aus diesem Expressionsvektor mittels PCR durch geeignete

Primer isoliert und in zwei E. coli/P. pastoris-Schaukelvektoren (pPICZαA und pGAPZαA)

kloniert. Die Vektoren unterschieden sich in den zur Kontrolle der ROL-Expression ver-

wendeten Promotoren und ihrem Integrationsort in der Hefe. Während in pGAPZαA die Ex-

pression des heterologen Gens konstitutiv erfolgt, ist bei pPICZαA die gezielte Induktion der

Expression zu einem bestimmten Zeitpunkt möglich.

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