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2. ERGEBNISSE 49

hier das Ansetzen mehrerer Kulturen empfehlenswert. Der zeitliche Aufwand ist mit dem für

die Elektroporation vergleichbar, auch hier ist es nicht möglich, kompetente Zellen zu lagern.

Mit dieser Methode konnten in fünf Versuchen keine positiven Transformanten erzeugt

werden. Auch die Variante mit LiAc ergab keine Transformanten.

Tabelle 2.1: Vergleich der verschiedenen Transformationsmethoden für Pichia pastoris

X-33 transformiert mit pPICZα_ROL

Methode Anzahl

Transformanten

(Maximal)

Anzahl positiver

Transformationen

(von fünf)

Lagerung

kompetenter

Zellen

Aufwand

)

Elektroporation

nach Invitrogen

5-10 5 nein ++

LiCl-Methode 0 0 nein ++

"Easy Comp Kit"

1-4 3 ja +

Elektroporation

vereinfacht

100-200 5 nein +

++ = zeitaufwendig; + = wenig zeitaufwendig

Die dritte Methode zur Transformation ist die Verwendung des "Easy Comp Kits" von

Invitrogen. Diese entspricht in seinen Grundzügen der LiCl Transformation, die genaue

Zusammensetzung der verschiedenen Lösungen ist jedoch nicht veröffentlicht. In dieser

Methode sticht vor allem die Möglichkeit, kompetente Zellen zu lagern, positiv hervor. Da-

durch ist es möglich, einmal Zellen in größerem Maßstab bis zu einer OD

600

von 1,0 zu kulti-

vieren und diese nach dem Einfrieren zu einem späteren Zeitpunkt zu verwenden. Es wurde

sogar berichtet, daß die Effizienz nach dem Einfrieren steigen kann (M. Vanetti, Invitrogen,

persönliche Mitteilung).

Die letzte verwendete Methode ist eine vereinfachte Variation der Elektroporationsmethode

nach Invitrogen. Es wurden zwei Impfösen Pichia pastoris Zellen von einer YPD-Platte

entnommen und über Nacht in 200 ml YPD Medium in einem 2 l Kolben bei 30 °C kultiviert.

Wichtigster Parameter war die OD

600

vor dem Zentrifugieren. Von dieser hing später das

gewählte Volumen für die Resuspendierung ab. Nach mehreren Waschschritten mit Wasser

bzw. 1 M Sorbitol wurde das verbleibende Pellet in 1 ml 1 M Sorbitol pro OD

600

1,3

resuspendiert und elektroporiert. Die Zellen konnen nach dem Einfrieren nicht mehr

erfolgreich transformiert werden. Die Methode ging jedoch sehr schnell und ergab in etwa

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