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2. ERGEBNISSE 79

2.4.1.4 Sequenzierung der erzeugten HeliTags zur Validierung ihrer Diversität

Alle sequenzierten RandomHeliTags wiesen unterschiedliche Aminosäuresequenzen auf,

einige Beispiele hierfür zeigt Tabelle 2.6. Auch einige Kolonien, die keine Fluoreszenz

zeigten, wurden sequenziert. Diese enthielten alle mindestens ein Stopcodon (z. B. A8, Z4,

Z11, Z13). Da die HeliTags jedoch an das 5´-terminale Ende des EGFP-Gens integriert

wurden, konnte es also in diesen Fällen gar nicht zur Expression des EGFP kommen.

Tabelle 2.6 :Aminosäuresequenz einiger RandomHeliTags

Name AS1 AS2 AS3 AS4 AS5 AS6 AS7 AS8 AS9 As10

A 1 His Gly His Met Glu Arg Cys Leu Val Cys EGFP

A 2 His Lys His Ala Arg Ser Cys Met Gly Cys EGFP

A 3 His Phe His Thr Val Phe Cys Phe Ser Cys EGFP

A 4 His Arg His Arg Gly Met Cys Thr Ala Cys EGFP

A 6 His Gln His Glu Gly Arg Cys Lys Glu Cys EGFP

A 8 His Cys His Pro Glu Leu Cys Stop Leu Cys EGFP

M 13 His Asn His Arg Tyr Gly Cys Gly Cys Cys EGFP

M 14 His Ser His Ser Val Gly Cys Phe Phe Cys EGFP

M 15 His Gly His Thr Leu Ser Cys Gly Leu Cys EGFP

M 16 His Ser His Thr Leu Arg Cys Lys Gly Cys EGFP

Z 4 His stop His Asn stop Val Cys Ala Thr Cys EGFP

Z 5 His Arg His Gly Thr Asn Cys Leu Lys Cys EGFP

Z 7 His Ile His Gln Ser Asn Cys Gln Val Cys EGFP

Z 8 His Lys His Val Asp His Cys Gly Arg Cys EGFP

Z 9 His Ser His Leu Thr Leu Cys Leu Gly Cys EGFP

Z 10 His Thr His Gln Ser Gln Cys Gly Arg Cys EGFP

Z 11 His Thr His Ala Ser Gly Cys stop stop Cys EGFP

Z 13 His Cys His Thr Trp Cys Cys Asn stop Cys EGFP

Z 14 His Arg His Leu Phe Trp Cys Ser Glu Cys EGFP

2.4.1.5 Fusion der Nickelbindungsstelle der ATPase 439 (WtHeliTag) aus Helicobacter

pylori an EGFP

Um die Eigenschaften der gefundenen HeliTags mit dem WtHeliTag vergleichen zu können,

wurde das EGFP mit den Primern GFP_WT_1 und GFP_WHO_2 amplifiziert. Dabei wurde

an das 5´-terminale Ende des EGFP Gens die orginal Nickelbindungsstelle aus der ATPase

439 aus Helicobacter pylori fusioniert. Zusätzlich wurden wieder die Schnittstellen NcoI am

5´-terminalen Ende und NotI am 3´-Ende des EGFP-Gens eingeführt. Das PCR-Produkt und

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