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5. MATERIAL & METHODEN 126

getrennt und der Elternstrang steht für den nächsten Programm-Zyklus (siehe Tabelle 5.12,

vergleiche mit Tabelle 5.8) als Template zur Verfügung. In der Regel wird dieser Zyklus 25-

30 mal wiederholt.

Im Quik Change-Ansatz ist nach der Amplifikation ein Gemisch aus Template – ohne die

gewünschte Mutation – und neu synthetisierter DNA – mit der gewünschten Mutation – vor-

handen, welches bei sofortiger Transformation zu einem Gemisch von Klonen mit und ohne

Mutation führen würde. Da sich die Plasmide kaum unterscheiden, würde das einen erhebli-

chen Aufwand bedeuten, eine Mutante zu identifizieren.

Da nun aber DNA aus lebenden Zellen methyliert vorliegt, die in vitro hergestellte jedoch

nicht, kann man diese durch Verdau mit DpnI das Ausgangsplasmid selektiv entfernen.

Dieses Enzym verdaut selektiv nur methylierte DNA, so daß nur die in vitro neu synthetisierte

DNA nach dem Verdau übrig bleibt.

Pfu DNA

Polymerase

Dpn

XL1-Blue

Abbildung 5.1: Schematische Darstellung der Mutagenese mit Quick Change.

Die roten Kreise markieren die Stelle der gewünschten Mutation, Primer

sind blau dargestellt, die Querbalken deuten die bei der in vitro Synthese

enstehenden Einzelstrangbrüche des Tochterstrangs an, die nach dem Ver-

dau mit DpnI und der Transformation in Epicurian coli in vivo repariert

werden.

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