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2. ERGEBNISSE 82

GFP 30 kDa

Nach der IMAC Reinigung der einzelnen Mutanten in den Membranfilterplatten befüllt mit

Chelating Sepharose (siehe 5.9) wurde die Fluoreszenz in den Wasch- und Elutionsschritten

bestimmt. Hierbei wurden rund 1000 Mutanten durchmustert. Von diesen wurden die 25

besten HeliTags aus dem Plattentest ausgewählt und in einer genaueren Untersuchung in

einem Medium-Throughput Screening Ansatz mit Ni-NTA Säulen (Qiagen) untersucht. Die

dabei erzielten Ergebnisse gaben schon einen guten Aufschluß über Ausbeute und Elutions-

verhalten der unterschiedlichen Tags, auch wenn selbst bei einem guten HeliTags 50 % des

GFP ungehindert durch die Säule fließen (Abbildung 2.22).

Durch Verwendung von drei Elutionsschritten mit alternierender Imidazol-Konzentrationen

konnten eindeutige Unterschiede zwischen dem Verhalten einzelner Tags, bzw.

"ungetaggtem" Protein nachgeweisen werden. Die Reinigung des EGFP mit dem HeliTag

M13 zeigt, daß schon mit den Ni-NTA Säulen von Qiagen eine sehr gute Reinigung möglich

ist (Abbildung 2.23). Aus dem MTS wurde der HeliTag M13 als der vielversprechenste

selektiert und weiter untersucht.

Abbildung 2.23: PHAST Gel der Reinigung von EGFP mit dem HeliTag M13 mit Ni-

NTA-Säulen.

1 LMW Standard; 2 Aufschluß; 3 Durchfluß; 4 Waschen; 5 Elution.

1 2 3 4 5

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