Bosch PPS8 C2 Series Manual do Utilizador descarregar pdf (Página 105)

3. DISKUSSION 104

Wildtyp, sehr stark an die Verwendung von Nickel als Metallsalz gebunden, da die Bindung

an Zink zu schwach zur Verwendung in der IMAC ist. Kupfer bindet an den HeliTag M13

und den WtHeliTag stärker als an die Matrix, was zu einem Ausbluten der Säule bei der Elu-

tion kommt.

Der HeliTag M13 konnte durch die Insertion der Faktor X

-Schnittstelle rückstandslos vom

EGFP a/jointfilesconvert/483621/bgetrennt werden, ohne daß Veränderungen in den Charakteristika sowohl des

Proteins, als auch der Eigenschaften des HeliTags M13 gefunden werden konnten. Dies ist

insbesondere bei der Zulassung von pharmazeutischen Proteinen erforderlich, da es sonst

beim Einsatz von diesen Fusionsproteinen z. B. zu unerwünschten Immunreaktionen kommen

kann.

Mit dem in dieser Arbeit entwickelten HeliTag M13 konnte gezeigt werden, daß durch die

Variation der Metallbindungsstelle der ATPase 439 Peptidsequenzen mit unterschiedlichen

Eigenschaften erzeugt werden konnten. In der vorliegenden Arbeit wurde so ein Tag ge-

funden, der bessere Ausbeuten als der HisTag bietet. Durch die Variation der Screening

Bedingungen ist jedoch auch das Auffinden von Tag-Sequenzen mit anderen Eigenschaften

möglich, z. B. einer schwächeren Bindung, um noch schonendere Elutions-Bedingungen zu

ermöglichen.

3.5.3 Klonierung des HeliTags M13 an die ROL zur IMAC

Der HeliTag M13 wurde N-terminal erfolgreich an die Lipase BTL-2 aus Bacillus

thermocatenulatus fusioniert und in E. coli exprimiert. Das Fusionsprotein konnte an-

schließend erfolgreich durch IMAC aufgereinigt werden (Heckleroth, persönliche Mitteilung).

In der vorliegenden Arbeit wurden drei Konstrukte zur Fusion des HeliTags M13 an die ROL

hergestellt. So wurde im Fall von pPICZαΑ_ΗeliN der HeliTag M13 an das 5´- sowie bei

pPICZαΑ_ΗeliC bzw. pPICZαΑ_X

ΗeliC an das 3´-Ende des ROL Gens fusioniert. Das

Plasmid pPICZαΑ_X

ΗeliC beinhaltete erneut die Erkennungssequenz für den Faktor X

zur

rückstandslosen Abspaltung des HeliTags.

Die Expression der Fusionsproteine ergab jedoch keine, bzw. nur wenig Lipaseaktivität im

Überstand. Während im Fall der C-terminal fusionierten Tags überhaupt keine Lipaseaktivität

mehr detektiert werden konnte, zeigte das Fusionsprotein mit dem N-terminal fusionierten

1 2 ... 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 ... 152 153

Sem comentários

Bosch PPS8 C2 Series Manual do Utilizador Página 105