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2. ERGEBNISSE 63

2.3 Aufreinigung und Charakterisierung der ROL aus Pichia pastoris

2.3.1 Reinigung der in komplexem Medium kultivierten ROL aus Pichia pastoris

(Kultivierung in Schüttelkolben).

Die Sekretion der reifen Lipase in aktiver Form durch P. pastoris in das Medium machte eine

Reihe von Aufarbeitungsschritten, die für die Expression in E. coli entwickelt wurden, über-

flüssig. Die Analyse der angefertigten SDS-Gele ergab jedoch, daß im Überstand noch

kontaminierende Proteine enthalten waren. Daher wurde ein Zweischritt-Reinigungsprotokoll

entwickelt, das sich an die Reinigung der renaturierten Lipase, produziert in E. coli anlehnt

(siehe Abbildung 2.14):

Der aus Kulturen im Schüttelkolben (500 ml in einem 2000 ml Erlenmeyerkolben mit einer

lipolytischen Aktivität von 110 U

-1

bzw. einer spezifischen Aktivität von 13,6 U mg

-1

)

stammende Kultivierungsüberstand wurde, um die Pichia Zellen abzutrennen zentrifugiert.

Das verbleibende Medium wurde mit einer 10 kD Membran gegen Wasser diafiltriert. Dieser

Schritt diente zwei Zielen: Erstens konnte damit der Kultivierungsüberstand auf ein Fünftel

reduziert werden, was die Handhabung im zweiten Schritt vereinfacht, andererseits konnte

damit schon ein Teil der verunreinigenden Peptide, sowie der im nächsten Auf-

arbeitungsschritt störenden Salze entfernt werden (siehe Tabelle 2.2). So konnte der erhaltene

Überstand (100 ml mit einer lipolytischen Aktivität von 470 U ml

-1

bzw. 23,1 U ml

-1

) direkt

chromatographiert werden.

Tabelle 2.2: Reinigungstabelle für ROL aus dem Kultivierungsüberstand aus 500 ml

Schüttelkolbenkulturen von Pichia pastoris GS115 in komplexem Medium

Volumen der

Lipaselösung

(ml)

Reinigungsschritt Gesamt-

volumen-

aktivität

(U)

spez. Aktivität

(U ml

-1

)

Reinigungs-

faktor

Gesamt-Ausbeute

(Ausbeute je

Reinigungsschritt)

(%)

500 - 55000 13,6 - -

100 Diafiltration 47000 23,1 1,7 86 (86)

112 Ionenaustausch-

chromatographie mit

SP-Sepharose

16800 8571 363 31 (36)

28 Konzentration 16700 8571 1 31 (100)

Alle angaben in U wurden im pH Stat mit Triolein als Substrat bestimmt (pH 8,1; 30 °C)

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