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INHALTSVERZEICHNIS 4

1.4 AUFGABENSTELLUNG______________________________________________40

2ERGEBNISSE____________________________________________41

2.1 KLONIERUNG UND EXPRESSION DER LIPASE AUS RHIZOPUS ORYZAE IN PICHIA

PASTORIS

________________________________________________________41

2.1.1 KLONIERUNG DES GENS DER REIFEN ROL IN PPICZαA UND PGAPZαA____________________41

2.1.2 T

RANSFORMATION UND EXPRESSION DER ROL IN PICHIA PASTORIS GS 115 (HIS 4)____________44

2.1.2.1 Durchmusterung verschiedener mit pPICZαA_ROL transformierter Klone auf ihre Fähigkeit

ROL zu produzieren____________________________________________________________45

2.1.2.2 Bestimmung des Phänotyps verschiedener Pichia pastoris Klone transformiert mit

pPICZαA_ROL _______________________________________________________________46

2.1.2.3 Durchmusterung verschiedener Klone transformiert mit pGAPZαA_ROL auf ihre Fähigkeit

ROL zu produzieren____________________________________________________________47

2.1.3 T

RANSFORMATION UND EXPRESSION DER ROL IN PICHIA PASTORIS X-33 ___________________48

2.1.4 V

ERGLEICH VERSCHIEDENER TRANSFORMATIONSMETHODEN ZUR TRANSFORMATION VON

PICZαA_ROL IN PICHIA PASTORIS X-33 ___________________________________________48

2.1.5 K

LONIERUNG, TRANSFORMATION UND EXPRESSION VON ROL IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE __50

2.2 FERMENTATION VON PICHIA PASTORIS ZUR ROL PRODUKTION ____________51

2.2.1 KULTIVIERUNG IN KOMPLEXEM MEDIUM MIT UNMITTELBARER INDUKTION _________________51

2.2.2 K

ULTIVIERUNG IN KOMPLEXEM MEDIUM MIT GLYCERIN FED-BATCH ______________________53

2.2.3 K

ULTIVIERUNG IN SYNTHETISCHEM MEDIUM OHNE METHANOL-ANALYTIK _________________54

2.2.4 B

ESTIMMUNG DES METHANOL-GEHALTS DES FERMENTATIONSÜBERSTANDS ________________57

2.2.5 K

ULTIVIERUNG IN SYNTHETISCHEM MEDIUM MIT METHANOL-ANALYTIK___________________59

2.2.6 K

ULTIVIERUNG MIT GLYCERIN-METHANOL MISCHFÜTTERUNG___________________________60

2.3 AUFREINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER ROL AUS PICHIA PASTORIS__63

2.3.1 REINIGUNG DER IN KOMPLEXEM MEDIUM KULTIVIERTEN ROL AUS PICHIA PASTORIS

(KULTIVIERUNG IN SCHÜTTELKOLBEN)._____________________________________________63

2.3.2 R

EINIGUNG DER IN SYNTHETISCHEM MEDIUM KULTIVIERTEN ROL AUS PICHIA PASTORIS,

ERMENTATION 6)_____________________________________________________________66

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