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4. ZUSAMMENFASSUNG 107

Die Expression unter Kontrolle des pAOX Promotors war ungefähr doppelt so hoch wie die

unter Kontrolle des pGAP Promotors, weshalb er für weitere Arbeiten den Promotor der Wahl

darstellte.

Der für die ersten Untersuchungen verwendete Pichia-Stamm GS115 enthält eine Deletion

des His 4 Genes. Bei der Kultivierung in synthetischem Medium stört diese Deletion jedoch,

da sie die Supplementierung von Histidin erfordert. Aus diesem Grund wurde ROL unter

Kontrolle des AOX Promotors auch im Pichia Wildtyp-Stamm X-33 exprimiert.

Außerdem wurden zwei rationale Mutanten realisiert (L258W u. L258Y), von denen auf

Grund von Molecular Modelling Untersuchungen eine gegenüber dem Wildtyp geänderte

Stereopräferenz bei der Spaltung von Triglycerin Analoga vermutet wird.

Die reife ROL konnte erfolgreich in komplexen Medium im Schüttelkolben kultiviert und

aktiv in das Medium sekretiert werden. Durch Fermentation konnte die Lipaseaktivität im

Überstand von 110 U ml

-1

bis auf 500 U ml

-1

gesteigert werden, ein Wert, der mit der

Produktion in E. coli bei gleichem Volumen vergleichbar ist. Die Kultivierung in komplexem

Vollmedium ist jedoch teuer, weshalb die Kultivierung der ROL in synthetischem Medium

untersucht wurde. Durch die Variation und Optimierung der Fütterungsstrategie und Kon-

trolle des Methanol-Gehalts im Fermenter konnte die Ausbeute auf 1300 U ml

-1

gesteigert

werden. Die Lipase aus den verschiedenen Kultivierungen in komplexem Medium konnte

durch einen Konzentrierungs- und einen Chromatographieschritt bis zur Homogenität

aufgereinigt werden. Die Untersuchung der biochemischen Eigenschaften der in Pichia

pastoris exprimierte ROL ergab, daß diese der in E. coli exprimierten vergleichbar ist,

allerdings besitzt die in P. pastoris exprimierte eine erhöhte Thermostabilität.

Die Metall-Affinitätschromatographie wird in zunehmendem Maße als Einschrittreinigung

verwendet. Da der am häufigsten verwendete HisTag jedoch einige Nachteile besitzt, wurde

ein neuer Metall-Affinitätstags, ausgehend von der zehn Aminosäuren großen Nickel-

bindungsstelle einer ATPase aus Helicobacter pylori, entwickelt. In dieser Metallbindungs-

stelle wurden vier Aminosäuren fixiert, die für die Bindung essentiell sind und sechs Amino-

säuren variiert. Unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden wurde eine, an EGFP

als Reporter fusionierte Peptidbibliothek erstellt, die mit Hilfe eines Hochdurchsatz-

Screenings mit Membran-Filterplatten durchmustert wurden. Damit konnte schon nach dem

Screenen von nur ca. 1000 Klonen ein Peptid gefunden werden, das gegenüber dem HisTag

verbesserte Eigenschaften aufwies.

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