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5. MATERIAL & METHODEN 118

zur Transformation verwendet oder langsam bei –80 °C eingefroren. Zur Transformation

wurden ca. 3 µg geschnittener DNA in 5 µl dH

O gelöst verwendet. Darauf folgte die

Mischung von 1 ml Lösung II des Kits (PEG, Konzentration nicht bekannt) mit dem Trans-

formationsansatz. Im Verlauf der 1 stündigen Inkubationszeit (30 °C, 225 rpm), wurde die

Zellsuspension alle 15 Minuten vorsichtig durchmischt. Anschließend wurde die Inkuba-

tionstemperatur auf 42 °C erhöht und 10 Minuten beibehalten. Nach Zugabe von 2 ml YPD

Medium und einer weiteren Stunde Inkubation (30 °C, 225 rpm) wurde der Transformations-

Ansatz 5 Minuten bei 3000 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Anschließend wurde

das Pellet in 1 ml Lösung III (Salz-Lösung, Zusammensetzung nicht bekannt) resuspendiert,

zentrifugiert (3000 x g, RT, 5 Min) und in 100 µl Lösung III resuspendiert bevor die trans-

formierten Zellen zur Selektion auf YPDS (YPD + 1M Sorbitol) Platten mit Zeocin

(100 µg ml

-1

) ausplattiert wurden.

5.5.2.12 Transformation von Pichia pastoris mit der LiCl Methode

Pichia pastoris wurde in einer 50 ml YPD-Kultur bis zu einer OD

600

von 1,0 kultiviert und

zentrifugiert (1500 x g, 10 Min, RT). Das Zellpellet wurde in 25 ml dH

O resuspendiert und

erneut zentrifugiert (1500 x g, 10 Min, RT). Danach wurden die Zellen in 1 ml LiCl

(100 mM) resuspendiert, nochmals zentrifugiert (11100 x g, RT, 15 s) und die LiCl-Lösung

entfernt. Schließlich wurden die Zellen in 400 µl LiCl-Lösung resuspendiert, in 50 µl

Portionen aliquotiert und nochmals zentrifugiert (11100 x g, RT, 15 s). Zu jedem Ansatz

wurden 240 µl PEG-Lösung (50 % (w/v) PEG-3350), 36 µl LiCl (1 M), 25 µl gekochte Lachs

Sperma DNA (2 mg ml

-1

) und 5-10 µg DNA, gelöst in 50 µl dH

O zugegeben, bevor das

Gemisch bis zur völligen Suspendierung der Zellen durchmischt und 30 Minuten bei 30 °C

inkubiert wurde. Nachdem der Transformationsansatz 25 Minuten bei 42 °C inkubiert und bei

2700 x g zentrifugiert wurde, wurde der Überstand entfernt, das verbleibende Zellpellet in 1

ml YPD Medium resuspendiert, 1 h bei 30 °C inkubiert und auf YPDS-Platten (YPD + 1 M

Sorbitol) mit Zeocin (100 µg ml

-1

) ausplattiert.

Minimalagar zum Nachweis zur Lipaseexpression in Pichia pastoris

Die auf YPDS Agar gebildeten Kolonien wurden auf einen Minimalagar (Tabelle 5.6) mit

Tributyrin überführt. Nach 24 h Inkubation bei 30 °C wurde in den Deckel der Agarschale 1-2

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