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2. ERGEBNISSE 41

2 Ergebnisse

2.1 Klonierung und Expression der Lipase aus Rhizopus oryzae in

Pichia pastoris

2.1.1 Klonierung des Gens der reifen ROL in pPICZαA und pGAPZαA

Das für die Lipase aus Rhizopus oryzae kodierende Gen wurde von Beer et al. (Beer 1994,

Beer, et al. 1998) aus einer partiellen Genbank isoliert und in E. coli überexprimiert. Der für

die Lipase kodierende open reading frame (offenes Leseraster, ORF) wurde in den

Expressionsvektor pCYTEXP1 unter Kontrolle des, durch Temperaturwechsel induzierbaren

λ-Promotors (PRPL) direkt hinter die OmpA-Leadersequenz zur Direktion der Lipase in das

Periplasma kloniert. Das entstandene Plasmid (pT1OmpAROL, siehe Abbildung 2.1) enthielt

außerdem eine Ampicillin Resistenz zur Selektion positiver Transformanten und zum

Verbleib des Plasmids in der Zelle. Dieser Expressionsvektor pT1-OmpAROL (Beer 1994)

diente in der vorliegenden Arbeit als Matritze für die PCR Reaktion zur Klonierung und

Expression des ROL-Gens in der Hefe Pichia pastoris.

Zu diesem Zweck wurden zwei kommerzielle Expressionsvektoren pPICZαA und pGAPZαA

(Invitrogen, Ca., siehe Abbildung 2.2) verwendet. Diese beiden Schaukelvektoren, die sowohl

in E. coli, wie in Pichia pastoris transformiert werden können enthalten beide ein Resistenz-

gen (Shl ble) gegen Zeocin zur Selektion positiver Transformanten, das sowohl in E. coli wie

in Pichia pastoris zur Selektion von positiven Transformanten verwendet werden kann. Eben-

falls in beiden Vektoren vorhanden ist der α-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae, der

fusioniert an das Lipasegen auch in Pichias pastoris für die Sekretion der Lipase aus der Hefe

sorgt.

Die beiden Vektoren unterscheiden sich in dem verwendeten Promotor: Der AOX-Promotor

in pPICZαA wird durch die Verwendung von Methanol als C-Quelle induziert, bzw. in An-

wesenheit von Glycerin, Glukose u. a. reprimiert. Im Gegensatz dazu wird bei der Verwen-

dung des GAP-Promotors in pGAPZαA das entsprechende Gen konstitutiv exprimiert.

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