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5. MATERIAL & METHODEN 114

schem Medium mit Galaktose resuspendiert. Die OD

600

der Suspension wurde bestimmt und

eine 50 ml Kultur mit synthetischem Medium mit Galaktose so angeimpft, daß eine Start

600

von 0,4 erreicht wurde. Nach 24 h wurde nochmals Galaktose (10 g l

-1

) zugegeben.

Nach 48 h wurde die Kultur zentrifugiert und der Überstand zur Bestimmung der Lipase-

aktivität konzentriert.

Selektion von Transformanten durch Uracil Auxotrophie:

Selektions

Medium

Glukose (20 g l

-1

), Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren (1,7 g l

-1

), AS-Mix (2

g l

-1

), Ammoniumsulfat (5 g l

-1

)

AS-Mix Adenin (2,0 g) L-Alanin (2,0 g), L-Arginin (2,0 g), L-Asparagin (2,0 g),

L-Aspartat (2,0 g), L-Cystein (2,0 g), L-Glutamin (2,0 g), L-Glutamat (2,0 g),

L-Glycin (2,0 g), L-Histidin (2,0 g), L-Lysin (2, 0 g), L-Leucin (2,0 g), myo-

Inositol (2,0 g), L-Isoleucin (2,0 g), L-Methionin (2,0 g), L-Phenylalanin (2,0 g)

L-Prolin (2,0 g), L-Serin (2,0 g), L-Threonin (2,0 g), L-Tryptophan (2,0 g),

L-Valin (2,0 g) PABA (0,2 g)

Zur Herstellung von Platten wurden 14 g l

-1

Agar zugegeben.

5.5.2.5 Transformation von Saccharomyces cerevisiae

Der Stamm INVSc2 (ura

, his

; Invitrogen) wurde zur Transformation mit der Lithiumacetat-

Methode nach Gietz et al. verwendet (Gietz, et al. 1995):

Bei dieser wurde die Hefe in 50 ml YEPD Medium kultiviert, bis eine OD

600

von 1- 2 erreicht

wurde. Anschließend wurden die Zellen bei 3600 rpm zentrifugiert und das Zellpellet zwei-

mal mit demselben Volumen Wasser und einmal mit Li-Acetat-Lösung (0,1 M, pH 7,5) gelöst

in TE (Tris (10 mM), EDTA (1 mM); pH 7,5) gewaschen. Daraufhin wurde das Pellet in Li-

Acetat-Lösung (250 µl) resuspendiert und 50 µl dieser Lösung wurden mit 1 µg DNA, 20-

40 µg Lachssperma DNA und 300 µl PEG 3350-Lösung (50 % (w/v) in Li-Acetat-Lösung)

vermischt. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 30 °C inkubiert und dann für 20 Minuten

einem Hitzeschock von 42 °C ausgesetzt. Nach der Zentrifugation der Zellen zur Konzentrie-

rung und Resuspendierung mit der verbliebenen Lösung wurden die Zellen auf Selektionsme-

dium ausplattiert (siehe 5.5.2.4)

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