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5. MATERIAL & METHODEN 125

dem Filtrieren der Lösung wurden 24 µl TEMED, sowie 180 µl APS-Lösung (10 %(w/v)) zu-

gegeben bevor sie zwischen zwei Glasplatten gegossen wurde.

Nach dem Auspolymerisieren wurde das Gel in den Sequenzer eingebaut und die Proben auf-

getragen.

Die DNA Fragmente bewegen sich in diesem Gel auf Grund ihrer unterschiedlichen Größe

mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Durch die Markierung der Basen mit den unter-

schiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen kann festgestellt werden, mit welcher Base ein DNA

Fragment endet. Die Leseköpfe der DNA Sequenzer detektieren die Abfolge der Fluoreszenz-

farbstoffe an einer bestimmten Stelle im Gel und bestimmen damit die Abfolge der dNTP´s.

5.6.7 Mutagenisierung mittels PCR

5.6.7.1 Mutagenisierung am Anfang und Ende eines Genfragments

Die PCR ist eine schnelle und einfache Methode um z. B. am Anfang und Ende eines Genes

Schnittstellen einzuführen. Hierzu wurden Primer verwendet, die neben der für das Gen

spezifischen Erkennungssequenz die Sequenz für die gewünschte Schnittstelle enthalten. Sind

die mit der Ziel-DNA komplementären Sequenzen ausreichend lang gewählt, hybridisiert der

Primer an die DNA des Gens und fusioniert damit die Schnittstelle an das Gen. In der vor-

liegenden Arbeit wurde diese Technik ebenfalls dazu verwendet, proteinbindende Sequenzen

wie den His-tag an Proteine zu fusionieren.

5.6.8 Mutagenisierung mittels Quik Change™

Die Mutagenisierung mittels Quick Change funktioniert ähnlich wie eine PCR, auch wenn es

genau genommen keine ist. In dieser wird das Plasmid nämlich nicht 2

fach wie die DNA in

der PCR amplifiziert, sondern nur 2n fach.

Zu dem Plasmid, das das zu mutierende Insert enthält, werden zwei Primer gegeben, die

komplementär zu je einem Strang der DNA sind und die die Punktmutation in etwa in der

Mitte des Oligonukleotids enthalten (siehe Abbildung 5.1, für einen typischen Quik Change-

Ansatz siehe Tabelle 5.11). Diese zwei Primer binden an das Plasmid und das ganze Plasmid

wird durch die Pfu-Polymerase synthetisiert, so daß zwei weitere DNA-Stränge entstehen, die

die gewünschte Mutation enthalten. Diese werden im nächsten Schritt wieder voneinander

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